食品中蛋白质含量测定方法集锦

2008年毒奶粉事件再次敲响了食品安全的警钟，不法分子为了提高掺水牛奶中蛋白质的含量，添加工业原料三聚氰胺，由于我国现行标准GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》中的2种方法“凯氏定氮法”和杜马斯（Dumas）燃烧法只能测出含氮量，然后根据氮元素与蛋白质换算系数计算蛋白质的含量，但并不能区分牛奶硝化后氮的来源，如果添加违规化学物质，就可以测出较高的“蛋白质含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，只要含氮量大于牛奶中蛋白质的化学物质，且性状和价格具备条件，在理论上都存在被不法分子利用的可能性。“定氮”方法的先天不足要求采用其它的检测方法来应对，下面介绍几种直接测定蛋白质的方法。

考马斯亮兰法：1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。在酸性溶液中，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合变为兰色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。此法灵敏度较高1～5μg，时间15min左右，干扰物质：强碱性缓冲溶液；SDS；TritonX-100。标准曲线有轻微的非线性，各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

双缩脲法：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4结合形成红紫色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能发生双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，蛋白质的种类虽不同，但发色率差别不大，组氨酸以外其它游离的氨基酸、二肽等不显色，除双缩脲、一亚氨基双缩脲、二亚氨基双缩脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少数化合物以外，非蛋白质均不显色，可以看做这是蛋白质的*反应，故可用来测定蛋白质含量。此法灵敏度较低1～20 mg，时间30 min左右，干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等，常用于需要快速，但并不需要十分的蛋白质测定。

Folin－酚试剂法：酚试剂法就是来自酚试剂（磷钼酸、磷钨酸的混合液），在碱性条件下，和蛋白质中芳香族氨基酸的呈色反应与双缩尿反应的复合方法。磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。此法灵敏度高5μg左右，时间1 h左右，干扰物质：尿素、硫酸纳、硝酸纳、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等，测定时要控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

紫外吸收光谱法：紫外吸收光谱法是直接测定芳香族氨基酸对紫外线吸收光谱（酪氨酸和色氨酸的zui大吸收为280nm）及肽键对紫外线吸收光谱（肽键的zui大吸收为190 nm）来定量蛋白质的一种分析方法。

凯氏定氮仪法：凯氏定氮仪作为测定蛋白质的仪器，广泛应用于乳与乳制品中蛋白质的含量的测定。凯氏定氮仪采用凯氏定氮法原理，即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。全自动凯氏定氮仪（http://www.dsddy.cn/）包括凯氏定氮仪蒸馏装置和消化炉，而其他的半自动定氮仪则不含有消化炉，需要在购买时自己配置单独的消化炉。